《蒙娜丽莎》是一幅享有盛誉的肖像画杰作。它代表达·芬奇的最高艺术成就，成功地塑造了资本主义上升时期一位城市有产阶级的妇女形象。画中人物坐姿优雅，笑容微妙，背景山水幽深茫茫，淋漓尽致地发挥了画家那奇特的烟雾状“无界渐变着色法”般的笔法。画家力图使人物的丰富内心感情和美丽的外形达到巧妙的结合，对于人像面容中眼角唇边等表露感情的关键部位，也特别着重掌握精确与含蓄的辩证关系，达到神韵之境，从而使蒙娜丽莎的微笑具有一种神秘莫测的千古奇韵，那如梦似的妩媚微笑，被不少美术史家称为“神秘的微笑”。
　　达·芬奇在人文主义思想影响下，着力表现人的感情。在构图上，达·芬奇改变了以往画肖像画时采用侧面半身或截至胸部的习惯，代之以正面的胸像构图，透视点略微上升，使构图呈金字塔形，蒙娜丽莎就显得更加端庄、稳重。另外，蒙娜丽莎的一双手，柔嫩、精确、丰满，展示了她的温柔,及身份和阶级地位，显示出达·芬奇的精湛画技和他观察自然的敏锐。
　　作者莱奥纳多·达·芬奇（1452-1519年）是15世纪意大利文艺复兴时期的文化名人，也是人类文明史上罕见的全才。他不仅是天才的画家、雕塑家、建筑师、诗人、哲学家和音乐家，而且是位很有成就的解剖学家、数学家、物理学家、天文学家、地理学家和工程师等等。500多年来，人们一谈起人类的文化进步，就会提及其中灿烂辉煌的一页——意大利文艺复兴时期，就要联想到达·芬奇的丰功伟绩。
　　500年来，人们一直对《蒙娜丽莎》神秘的微笑莫衷一是。不同的观者或在不同的时间去看，感受似乎都不同。有时觉得她笑得舒畅温柔，有时又显得严肃，有时像是略含哀伤，有时甚至显出讥嘲和揶揄。在一幅画中，光线的变化不能像在雕塑中产生那样大的差别。但在蒙娜丽莎的脸上，微暗的阴影时隐时现，为她的双眼与唇部披上了一层面纱。而人的笑容主要表现在眼角和嘴角上，达·芬奇却偏把这些部位画得若隐若现，没有明确的界线，因此才会有这令人捉摸不定的“神秘的微笑”。荷兰阿姆斯特丹的一所大学应用“情感识别软件”分析出蒙娜丽莎的微笑包含的内容及比例：高兴 83/100，厌恶 9/100，恐惧 6/100，愤怒 2/100。 

　　哈佛大学神经科专家玛格丽特·利文斯通博士说，蒙娜丽莎的微笑时隐时现，是与人体视觉系统有关，而不是因为画中人表情神秘莫测。利文斯通博士是视觉神经活动方面的权威，主要研究眼睛与大脑对不同对比和光暗的反应。利文斯通说：“笑容忽隐忽现，是由于观看者改变了眼睛位置。”她表示，人类的眼睛内有两个不同部分接收影像。中央部分(即视网膜上的浅窝)负责分辨颜色、细致印记。环绕浅窝的外围部分则留意黑白﹑动作和阴影。据利文斯通说，当人们看着一张脸时，眼睛多数集中注视对方的双眼。假如人们的中央视觉放在蒙娜丽莎的双眼，较不准确的外围视觉便会落在她的嘴巴上。由于外围视觉并不注重细微之处，无形中突出了颧骨部位的阴影。如此一来，笑容的弧度便显得更加大了。不过，当眼睛直视蒙娜丽莎的嘴巴，中央视觉便不会看到阴影。利文斯通说：“如果看着她的嘴巴，便永远无法捕捉她的笑容。”蒙娜丽莎的笑容若隐若现，源于人们的目光不断转移。利文斯通指出，若要临摹《蒙娜丽莎》，描绘口部时便要望着别处。 
　　1993年，加拿大美术史家苏珊·吉鲁公布了一项令人震惊的研究成果。她说蒙娜丽莎那倾倒无数观赏者的口唇，是一个男子裸露的脊背。这一论断既新鲜又荒诞，然而论证是有力的。集画家、雕刻家、建筑师、工程师及科学家等多种才艺于一身的达·芬奇，可谓是个“怪杰”。他喜欢穿粉红色外套，在胡须上毫无顾忌地涂上五颜六色，还常称自己解剖过不下30具死尸。他还是个左撇子，习惯从右到左倒着书写，别人要借助镜子才能读出他写的东西。因此借助镜子亦不失为欣赏者读画的一种方法。旋转90度后从镜中看蒙娜丽莎抿着的笑唇，恰好是一个背部线条分明的结实男性脊背以及左臂和肘部的一角；再说，表现人体美和呼唤人性的觉醒，既是大师的人生哲学，又是他的艺术观。 
　　确实，在不同角度不同光线下欣赏这幅画，人们都会得到不同的感受。那微笑时而温文尔雅，时而安详严肃，时而略带哀伤，时而又有几分讽嘲与揶揄，神秘莫测的微笑显露出人物神秘莫测的心灵活动。 
　　几百年来，“微笑”的新解层出不穷。诸如微笑不露皓齿是因原型虽典雅美丽却口齿不齐；原型因爱女夭折，忧郁寡欢，难掩凄楚之态；更有甚者，把蒙娜丽莎从贵妇宝座上推落下来，把原型贬为妓女，故而微笑中带着讥嘲和揶揄。 
　　美国马里兰州的约瑟夫·鲍考夫斯基博士认为：“蒙娜丽莎压根就没笑，她的面部表情很典型地说明她想掩饰自己没长门牙。” 
　　法国里昂的脑外科专家让·雅克·孔代特博士认为蒙娜丽莎刚得过一次中风，请看，她半个脸的肌肉是松弛的，脸歪着所以才显得微笑。 
　　英国医生肯尼思·基友博士相信蒙娜丽莎怀孕了。他的根据是：她的脸上流露出满意的表情，皮肤鲜嫩，双手交叉着放在腹部。性学专家推测：蒙娜丽莎刚刚经历了性高潮，所以才表现出令世人倾倒的微笑。 
　　还有一种近乎无稽之谈的说法：她的表情就像吃了苯氨基亚胺似的，显得很陶醉，这是吃完巧克力后人体内产生的一种欢愉激素。这种说法很少有人相信，因为当时还没有巧克力呢。 
　　比利时安特卫普大学 人类学教授辛科尔 肯瑞尔认为蒙娜丽莎有这样的微笑是因为她把饭吃饱了，因为她嘴角的弧度和她手轻放在自己的腹部上的动作与人类在饱食一顿之后的反应完全相同。
　　画中，左边的地平线比右边的低，蒙娜丽莎的左侧看上去比右侧大。历史上左边代表女性，体现达·芬奇崇拜女性。其实蒙娜丽莎与达芬奇的自画像有很多共通之处，埃及传说中主管男性生殖器的神叫阿蒙（Amon），主管女性生殖器的神叫伊西斯（Isis）——古代文字中曾将其读做LISA，因此Mona Lisa就是暗示AMON LISA，即蒙娜丽莎非男非女，是两性的结合体。